本发明公开了用于检测消毒灭菌的生物指示剂的制备与检测的新方法，该生物指示剂病毒是通过修饰缺失真病毒中的编码包膜蛋白的基因序列，并与其它病毒的包膜糖蛋白基因共转染293T细胞系而得到的假病毒颗粒。生物指示剂病毒和指示细胞系二者中有一者携带有荧光素酶报告基因。利用生物指示剂病毒感染指示细胞系后，上调荧光素酶基因表达，继而通过检验测试荧光素酶的表达情况以判断生物指示剂病毒的感染与复制效率。该生物指示剂病毒吸收不同剂量的臭氧、紫外线、钴源、加速器辐照后，可以梯度形式呈现灭活率。基于荧光素酶的生物指示剂病毒具有制
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 113430228 A (43)申请公布日 2021.09.24 (21)申请号 1.X C12Q 1/22 (2006.01) C12Q 1/66 (2006.01) (22)申请日 2021.05.26 C07K 14/165 (2006.01) (71)申请人 中核同辐（长春）辐射技术有限公司 C12Q 1/70 (2006.01) 地址 130000 吉林省长春市北湖科技开发 区盛业路770号(航空街与盛业路交汇 处) 申请人 吉林大学 (72)发明人 许文革单亚明刘洋聂娇娇 张宏岩邵明玉许庆一崔正华 李明泽 (74)专利代理机构 北京中政联科专利代理事务 所(普通合伙) 11489 代理人 何磊 (51)Int.Cl. C12N 15/85 (2006.01) 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (54)发明名称 用于检测消毒灭菌的生物指示剂的制备与 检测的新方法 (57)摘要 本发明公开了用于检测消毒灭菌的生物指 示剂的制备与检测的新方法，该生物指示剂病毒是通 过修饰缺失真病毒中的编码包膜蛋白的基因序 列，并与其它病毒的包膜糖蛋白基因共转染293T 细胞系而得到的假病毒颗粒。生物指示剂病毒和 指示细胞系二者中有一者携带有荧光素酶报告 基因。利用生物指示剂病毒感染指示细胞系后， 上调荧光素酶基因表达，继而通过检验测试荧光素酶 的表达情况以判断生物指示剂病毒的感染与复 制效率。该生物指示剂病毒吸收不同剂量的臭 氧、紫外线、钴源、加速器辐照后，可以梯度形式 A 呈现灭活率。基于荧光素酶的生物指示剂病毒具 8 有制备简单，结果可靠等优点，且使用起来更便捷快捷、 2 2 0 安全性高、可操作性强、灵敏度较高。 3 4 3 1 1 N C CN 113430228 A 权利要求书 1/1页 1.用于检测消毒灭菌的生物指示剂的制备方法，其特征是：包括以下步骤： S1、待293T细胞生长至70‑80％时准备转染，骨架质粒pSG3‑Δenv和包膜质粒 pcDNA3.1‑env质量比为4：1； S2、转染4h后，更换DMEM完全培养基(含10％FBS)，继续培养48h后收毒，完成生物指示 剂的制备。 2.一种通过权利要求1所述方法制备的用于检测消毒灭菌的生物指示剂，其特征是： 作为灭菌指示的生物指示剂应用在臭氧、紫外线、钴源、加速器消毒工作中。 3.依据权利要求2所述的一种用于检测消毒灭菌的生物指示剂，，其特征是：应用时， 应当满足以下的条件： 臭氧消毒灭菌的条件为：当空间湿度大于75％，浓度时间(CT)值定义为臭氧气体浓度 (ppm)乘以给药维持的时间(min)，如0.05ppm处理20小时或0.1ppm处理10小时； 2 紫外线消毒灭菌的条件为：位于辐射源下方20‑30cm，辐射强度为0.1mW/cm ，维持的时间 60 30秒、60秒、300秒；钴源消毒灭菌的条件为：‑78℃至10℃的温度下，使用 Coγ射线h的平均剂量率进行辐照，辐照总剂量在2kGy‑13kGy； 加速器消毒灭菌的条件为：将生物指示剂病毒包于细胞板并风干，于室温(2‑10℃)进 行加速器辐照后，使用完全培养基游离出吸附的病毒之后进行仔细的检测。 4.依据权利要求2或3所述的一种用于检测消毒灭菌的生物指示剂，其特征是：生物 指示剂的感染性 ‑4 ‑5 滴度TCID50为10 ‑10 /mL。 5.依据权利要求4所述的一种用于检测消毒灭菌的生物指示剂，其特征是：还包括与 所述生物指示剂对应使用的指示细胞系，所述指示细胞系为生物指示剂的易感细胞系。 6.依据权利要求5所述的一种用于检测消毒灭菌的生物指示剂，其特征是：生物指示 剂和指示细胞系二者中有一者携带有荧光素酶报告基因。 7.一种如权利要求5或6所述的用于消毒灭菌指示的生物指示剂的活性的检测的新方法，其 特征是包括以下步骤： 4 (1)在指示细胞稀释液中，加入终浓度为15μg/mL的DEAE‑Dextran，细胞按照1×10个/ 孔的量加入到96孔板中； (2)生物指示剂病毒依次进行5倍稀释； (3)使用荧光素酶底物检测； (4)TCID50的计算，首先计算Cutoff值，Cutoff＝3xC Caver(细胞对照均值)，在荧光值 中找到阳性个数和阴性个数，根据Reed‑Muench两氏法，得到TCID50/ml。 2 2 CN 113430228 A 说明书 1/4页 用于检测消毒灭菌的生物指示剂的制备与检测的新方法 技术领域 [0001] 本发明涉及消毒灭菌中生物监测技术领域，具体为用于检测消毒灭菌的生物指示 剂的制备与检测的新方法。 背景技术 [0002] 如王萍、张高红、郑永唐在其文章《基于假病毒筛选抗病毒药物的研究进展》中提 到假病毒是一种整合其他病毒囊膜糖蛋白所形成的具有外源性病毒囊膜、而自身基因组仍 保持着源病毒基因组特性的一类病毒。假病毒因丧失了病毒的自我复制能力，具有安全性 高等优点，已被大范围的使用在包括HIV、H5N1、HCV等病毒的研究。同时在该文章中给出结语：过去 的几十年里，已经确立了假病毒技术在病毒学基础研究、基因转导、中和抗体检测和治疗应 用中的主体地位，其将慢慢的变多地应用于基础研究和临床治疗中，特别在一些高致病性病 毒的研究中发挥着逐渐重要的作用。在疫苗的构建策略和基因治疗研究中，假病毒也是 近年来的研究热点。对于抗病毒药物研究领域，假病毒筛选平台也发挥着逐渐重要的作 用，相信随其功能体系的一直在优化，在抗病毒药物筛选中假病毒系统将实现标准化。假病 毒技术也存在着许多缺点，因感染和复制过程的不完全相同，假病毒不能完全替代活病毒， 经假病毒筛选后的活性物质仍需使用活病毒确证其活性，科学家们正致力于假病毒体系的 改良工作中。随着分子生物学和医学的发展，假病毒技术也将越来越成熟与完善，其应用领 域会慢慢的宽。 [0003] 从上面的文章中，我们大家可以明显看出，假病毒在病毒学的研究地位处于越来越重 要的位置，我们也应当，最大限度的对假病毒这一概念，进行深入的开发。相信假病毒的不 断应用能够让我们不断的深入病毒的机理，从而更好的应对当今世界形式下的各种纷繁复 杂的病毒，为人类的长久安稳发展奠定坚定的基石。 [0004] 针对上述的背景，本发明提出用于检测消毒灭菌的生物指示剂的制备与检测方 法。 发明内容 [0005] 本发明的目的在于提供用于检测消毒灭菌的生物指示剂的制备与检测的新方法，该指 示剂具有制备简单，结果可靠等优点，且使用方便快捷、安全性高、可操作性强、灵敏度高。 [0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：用于检测消毒灭菌的生物指示剂的 制备方法，包括以下步骤： [0007] S1、待293T细胞生长至70‑80％时准备转染，骨架质粒pSG3‑ Δenv和包膜质粒 pcDNA3.1‑env质量比为4：1； [0008] S2、转染4h后，更换DMEM完全培养基(含10％FBS)，继续培养 48h后收毒。 [0009] 优选的，一种用于检测消毒灭菌的生物指示剂，作为灭菌指示的生物指示剂应用 在臭氧、紫外线、钴源、加速器消毒工作中。在应用时，应当满足以下的条件：臭氧消毒灭菌 的条件为：当空间湿度大于75％，浓度时间(CT)值定义为臭氧气体浓度(ppm)乘以给药持续 3 3 CN 113430228 A 说明书 2/4页 时间(min)，如0.05ppm处理20小时或0.1ppm处理10 小时；紫外线消毒灭菌的条件为：位于 2 辐射源下方20‑30cm，辐射强度为0.1mW/cm ，持续时间30秒、60秒、300秒；钴源消毒灭菌的 60 条件为：‑78℃至10℃的温度下，使用 Coγ射线h的平均剂量 率进行辐照，辐照总剂量在 2kGy‑13kGy；加速器消毒灭菌的条件为：将生物指示剂病毒包 于细胞板并风干，于室温(2‑10℃)进行加速器辐照后，使用完全培养基游离出吸附的病毒 之后进行检测。 [0010] 优选的，生物指示剂的感染性 ‑4 ‑5 滴度TCID50为10 ‑10 /mL。 [0011] 优选的，还包括与所述生物指示剂对应使用的指示细胞系，所述指示细胞系为生 物指示剂的易感细胞系。 [0012] 优选的，生物指示剂和指示细胞系二者中有一者携带有荧光素酶报告基因。 [0013] 优选的，一种用于消毒灭菌指示的生物指示剂的活性的检测的新方法，其特征在于包 括以下步骤： [0014] (1)在指示细胞稀释液中，加入终浓度为15μg/mL的 DEAE‑Dextran，细胞按照1× 4 10个/孔的量加入到96孔板中； [0015] (2)生物指示剂病毒依次进行5倍稀释； [0016] (3)使用荧光素酶底物检测； [0017] (4)TCID50的计算，首先计算Cutoff值，Cutoff＝3xC Caver(细胞对照均值)，在荧 光值中找到阳性个数和阴性个数，根据 Reed‑Muench两氏法，得到TCID50/ml。 [0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： [0019] (1)本发明中的生物指示剂病毒与现有的臭氧、紫外线灭菌生物指示剂即枯草芽 60 孢杆菌和 Co辐照灭菌生物指示剂即短小芽孢杆菌相比，其与真实的病毒相似度更高、安全 性更高； [0020] (2)本发明中的生物指示剂病毒通过酶标仪检测荧光素酶的表达情况，其结果更 精准、灵敏度更高； [0021] (3)本发明中所含的生物指示剂病毒与指示细胞系互相独立存在，二者互不干扰， 病毒状态保持稳定，使产品在保质期和运输过程中稳定存在，检测过程更方便快捷。 附图说明 [0022] 图1为低温下(‑78℃)，钴源对生物指示剂的灭活效果评价图； [0023] 图2为室温下，加速器对生物指示剂病毒的灭活效果评价图。 具体实施方式 [0024] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本 发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实 施例，都属于本发明保护的范围。 [0025] 请参阅图1‑2，本发明提供的的实施例： [0026] 实施例1：用于检测消毒灭菌的生物指示剂的制备方法， [0027] 包括以下步骤： 4 4 CN 113430228 A 说明书 3/4页 [0028] S1、取T‑75细胞培养瓶培养293T细胞，待细胞生长至70‑80％时准备转染。 [0029] S2、将50μL Lipo2000加入到1.5ml空DMEM培养基中，取 20μg骨架质粒pSG3‑Δenv 和5μg包膜质粒pcDNA3.1‑env加入到 1.5ml DMEM培养基中，充分混匀后静置5min。 [0030] S3、将含有转染试剂的培养基缓慢加入含有质粒的培养基混合，室温孵育20min 后，加入到含有10mL空DMEM培养基的细胞培养瓶中。将细胞培养瓶置于CO 培养箱中孵育4h 2 后，更换10mL DMEM 完全培养基(含10％FBS)，继续培养48h。 [0031] S4、48h后，收取病毒液，于1000rpm离心5min，收取病毒上清液，按1mL/支分装后， 保存于‑80℃待用。 [0032] 实施例2：通过实施例1中的方法制备的生物指示剂，其作为灭菌指示的生物指示 剂应用在臭氧、紫外线、钴源、加速器消毒工作中。 [0033] 在应用时，应当满足以下的条件： [0034] 臭氧消毒灭菌的条件为：当空间湿度大于75％，浓度时间(CT) 值定义为臭氧气体 浓度(ppm)乘以给药持续时间(min)，如0.05ppm 处理20小时或0.1ppm处理10小时。 [0035] 2 紫外线消毒灭菌的条件为：位于辐射源下方20‑30cm，辐射强度为0.1mW/cm ，持续 时间30秒、60秒、300秒。 [0036] 60 钴源消毒灭菌的条件为：‑78℃至10℃的温度下，使用 Coγ射线h的平均剂量率进行辐照，辐照总剂量在2kGy‑13kGy。 [0037] 加速器消毒灭菌的条件为：将生物指示剂病毒包于细胞板并风干，于室温(2‑10 ℃)进行加速器辐照后，使用完全培养基游离出吸附的病毒之后进行检测。 [0038] 实施例3：用于检测消毒灭菌的生物指示剂，还包括与所述生物指示剂对应使用的 指示细胞系，所述指示细胞系为生物指示剂的易感细胞系。生物指示剂和指示细胞系二者 中有一者携带有荧光素酶报告基因。 [0039] 实施例4：用于检测消毒灭菌的生物指示剂，生物指示剂的感染性滴度TCID50为 ‑4 ‑5 ‑4 ‑5 ‑4 10 ‑10 /mL，包括10 /mL、10 /mL和0.5x10 /mL。 [0040] 实施例5：一种用于消毒灭菌指示的生物指示剂的活性的检测方法，其特征在于包 括以下步骤： [0041] (1)在指示细胞稀释液中，加入终浓度为15μg/mL的DEAE‑Dextran，细胞按照1× 4 10个/孔的量加入到96孔板中。 [0042] (2)生物指示剂病毒依次进行5倍稀释。 [0043] (3)使用荧光素酶底物检测。 [0044] (4)TCID50的计算，首先计算Cutoff值，Cutoff＝3xC Caver(细胞对照均值)，在荧 光值中找到阳性个数和阴性个数，根据 Reed‑Muench两氏法，得到TCID50/ml。 [0045] 同时为了探究不同消毒灭菌方式对于生物指示剂的灭活效果，提出以下两个对比 例。 [0046] 60 对比例1：钴源消毒灭菌的条件为：‑78℃至10℃的温度下，使用 Coγ射线h的平均剂量率进行辐照，辐照总剂量在2kGy‑13kGy。其结果为图1。 [0047] 对比例2：加速器消毒灭菌的条件为：将生物指示剂病毒包于细胞板并风干，于室 温(2‑10℃)进行加速器辐照后，使用完全培养基游离出吸附的病毒之后进行检测。其结果 为图2。 5 5 CN 113430228 A 说明书 4/4页 [0048] 从图1和图2我们可以看出：这两种消毒灭菌方式对于生物指示剂的灭活效果很 好。有利于生物指示剂作为指示剂进行使用。 [0049] 总结：本发明所述的生物指示剂是通过修饰缺失真病毒中的编码包膜蛋白的基因 序列，并与其它病毒的包膜糖蛋白基因共转染 293T细胞系而得到的假病毒颗粒。生物指示 剂和指示细胞系二者中有一者携带有荧光素酶报告基因。利用生物指示剂病毒感染指示细 胞系后，上调荧光素酶基因表达，继而通过检测荧光素酶的表达情况以判断生物指示剂病 毒的感染与复制效率。基于荧光素酶的生物指示剂病毒具有制备简单，结果可靠等优点，且 使用起来更便捷快捷、安全性高、可操作性强、灵敏度较高。 [0050] 综上所述，本发明的有益效果是：(1)本发明中的生物指示剂病毒与现有的臭氧、 60 紫外线灭菌生物指示剂即枯草芽孢杆菌和 Co 辐照灭菌生物指示剂即短小芽孢杆菌相比， 其与真实的病毒相似度更高、安全性更高；(2)本发明中的生物指示剂病毒通过酶标仪检测 荧光素酶的表达情况，其结果更精准、灵敏度更高；(3)本发明中所含的生物指示剂病毒与 指示细胞系互相独立存在，二者互不干扰，病毒状态保持稳定，使产品在保质期和运送过程 中稳定存在，检验测试过程更方便快捷。 [0051] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论 从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。 6 6 CN 113430228 A 说明书附图 1/1页 图1 图2 7 7
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