高压蒸汽灭菌锅是利用饱和压力蒸汽对物品进行迅速而可靠地消毒灭菌的设备，适用于医疗卫生、科研、农业等单位。可对医疗器械、敷料、玻璃器皿、溶液培养基等做消毒灭菌。
高压蒸汽灭菌锅按照样式和大小分为手提式高压蒸汽灭菌器、立式高压蒸汽灭菌器、卧式高压蒸汽灭菌器等。手提式高压蒸汽灭菌器的容积通常为18L、24L、30L。立式高压蒸汽灭菌器的容积范围通常为30L-200L，进一步又可分为手轮型、翻盖型、智能型。智能型又分为标准配置型、蒸汽内排型、真空干燥型。卧式高压蒸汽灭菌器通常为大型卧式高压灭菌锅。
首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。需要灭菌的物品按需要分类包装，物品包装用线绳捆扎，以不松动散开为宜，不宜过紧，培养皿等器皿需要用牛皮纸包扎。
灭菌锅内物品不能过挤，不能超过锅内容量。尽量将同类物品装在同一锅内灭菌。若有不同类物品装放在一起，应以难达到灭菌物品的所需温度和时间为准。物品装放时，上下左右均应交叉错开，留出缝隙，使蒸汽容易穿透。大灭菌包应立着放上层，小包放下层，布类和金属类物品同时灭菌时，应将金属类物品包放在下层，使两者受热基本一致，并防止金属物品灭菌中产生的冷凝水弄湿包布。
加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
打开电源加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。使用高压蒸汽灭菌器时，关键的是将锅内空气排尽。如锅内有空气，则气压针所指的压强不是饱和蒸汽产生的压强。相同的压强，混有空气的蒸汽其温度不高于饱和蒸汽所产生的温度。因此完全排除锅内空气使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。
常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力到的时间。
待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。
灭菌时间包括：穿透时间，从锅内达到灭菌温度开始到锅内难达到的部位也达到此温度所需要的时间；维持时间，即杀灭微生物所需要的时间，一般以杀灭嗜热脂肪杆菌芽胞所需时间来表示；安全时间，为使灭菌得到确切保证所要增加的时间，一般为热死亡时间的一半，其长短视灭菌物品而定。
对易导热的金属器材的灭菌，不需要安全时间。在灭菌时间内，要注意仔细观察压力表，以保持规定的压力，维持到灭菌时间为止。在灭菌过程中，如有压力、温度下降，应重新升温升压，重新计时。
达到灭菌时间后即可断电，一般当压力表的压力降至0之后，再打开排气阀。有时，在压力降到0.05MPa，可缓慢放出蒸汽，注意别使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后才能开盖，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。取出培养基摆在平台上以待冷凝，不可以长久不取出，否则会造成培养基成分变化以至无法制作斜面培养基。
如果因为久不放气导致锅炉内产生负压、盖子打不开，可以将放气阀打开，让空气进入，内外压力平衡后盖子就能打开了。取无菌物品时，要严格无菌操作。同时应分类放置，顺序发放取用。
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